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非著名兽医王清玉博客

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药敏试验-非著名兽医王清玉163博客  

2010-06-07 16:43:53|  分类: 兽医知识大餐 |  标签: |举报 |字号 订阅

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药敏试验根据美国临床标准委员会(NCCLS)推荐的K-B琼脂法进行,药敏纸片选择中国生物制品鉴定所药敏纸片,试验所选择药物必须包括下列抗生素:氨苄西林(AMP),阿莫西林/克拉维酸(AMC),头孢噻吩(CFT),头孢噻肟(CTX),庆大霉素(GEN),萘啶酸(NAL),环丙沙星(CIP),四环素(TBT),利福平(RFA),复方新诺明(SMZ)。药敏结果判定标准按照NCCLs手册2005版。 1. 操作方法: (1)将待检菌接种于普通营养琼脂平板,37℃培养16~18小时,然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落,悬于3ml生理盐水中,混匀后与菌液比浊管比浊。以有黑字的白纸为背景,调整浊度与比浊管(0.5麦氏单位)相同。 (2)用无菌棉拭子蘸取菌液,在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个M-H培养基表面,反复几次,每次将平板旋转60度,最后沿周边绕两圈,保证涂均匀。 (3)待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面,纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴5张纸片,每张纸片间距不少于24mm,纸片中心距平皿边缘不少于15mm。在菌接种后15分钟内贴完纸片。 (4)将平板反转,孵育18~24小时后取出,用游标卡尺测量抑菌圈直径,从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录(附表6)。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长,进入抑菌环,磺胺药在抑菌环内出现轻微生长,这些都不作为抑菌环的边缘。结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。 (5)每次药敏试验必须用ATCC 25922大肠杆菌做质控。只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株的结果才可以报告。ATCC 25922的结果必须与测试菌株同时记录和报告在附表6中。 0.5麦氏比浊管配制方法: 0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml 0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml 将二液混合,置螺口试管中,放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。 2. 注意事项: (1) 制备MH琼脂平板应用直径90mm平皿,在水平的实验台上倾注。琼脂厚为4±0.5mm(约25-30ml培养基),琼脂凝固后塑料包装放4℃保存,在5日内用完,使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴。倾注平皿前应用pH计测pH值是否正确(pH应为7.3)。pH过低会导致氨基糖苷类,大环内酯类失效,而青霉素活力增强。 (2) 药敏纸片长期储存应于-20℃,日常使用的小量纸片可放在4℃,但应至于含干燥剂的密封容器内。使用时从低温取出后,放置平衡到室温后才可打开,用完后应立即将纸片放回冰箱内的密封容器内。 过期纸片不能使用, 应弃去。 (3) 不稳定药物如亚胺培南, 头孢克洛, 克拉维酸复合药等, 应冷冻保存, 最好在-40 ℃以下。 (4) 保证质控菌株不变异的简便方法,将新得到的冻干菌株接种含血的M-H平板复活。然后每株细菌接种10支高层琼脂管,放置冰箱保存。每月取出一支,传出细菌供常规用。待用剩至最后一支,可传种在M-H平板上,再接种一批高层琼脂管备用。如此可保证原始菌种永不接触抗菌素。 3.质量控制 质量控制方法 是用与常规实验相同的操作方法,测定质控菌株的抑菌环。应使用新鲜传代的菌种。接种菌液的涂布方法等均同常规操作,测定的抗菌素种类也应与常规测定的种类相同。

一、实验材料

  普通营养琼脂培养基:可去生化试剂店购买,做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基,如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。

  药敏试纸:购买或自制(详见实验准备)

  细菌:待做药敏试验的细菌

  仪器:接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯、移液器、滴头

  

二、实验准备

  2.1 药敏片的准备:购买或自制

  2.1.1 制备方法:取新华1号定性滤纸,用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中,瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后,放在37℃温箱或烘箱中数天,使完全干燥。

  2.1.2 抗菌药纸片制作:在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升,并翻动纸片,使各纸片充分浸透药液,翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称,放37℃温箱内过夜,干燥后即密盖,如有条件可真空干燥。切勿受潮,置阴暗干燥处存放,有效期3-6个月。

  2.2 药液的制备(用于商品药的试验):按商品药的使用治疗量的比例配制药液;如商品药百病消按其说明量治疗量0.01%饮水,可按这个比例配制药液,可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。

  

三、实验操作方法

  3.1 药敏片法

  3.1.1 在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式;用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后,找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。(另:可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液,用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密)

  3.1.2 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停,取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴,可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果,要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上;一般可在平皿中央贴一片,外周可等距离贴若干片(外周一般可贴七片),每种药敏片的名称要记住。

  3.1.3 将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。

  3.2 牛津杯法
  3.2.1 在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式;用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后,找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。(另:可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液,用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。)

  

  3.2.2 以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管,管的两端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培养基上,轻轻加压,使其与培养基接触无空隙,并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。待分钟后,分别向各小管中滴加一定数量的各种药液,勿使其外溢。置37℃培养8-18小时,观察结果。

  3.2.3 将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。

  3.3 打孔法:

  该法较简单,成本低,易操作,比较适用于商品药物的检测。

  3.3.1 在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式;用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后,找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。(另:可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液,用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。)

  3.3.2 以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米,管的两端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培养基上打孔,将孔中的培养基用针头挑出,并以火焰封底,使培养基能充分的与平皿融合(以防药液渗漏,影响结果)。

  3.3.3 加样:按不同药液加样,样品加至满而不溢为止。

  3.3.4 将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。

结果观察

  在涂有细菌的琼脂平板上,抗菌药物在琼脂内向四周扩散,其浓度呈梯度递减,因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈,抑菌圈越大,说明该菌对此药敏感性越大,反之越小,若无抑菌圈,则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

判定标准

  一、药敏实验的结果,应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

  表1 药物敏感实验判定标准

抑菌圈直径(毫米) 敏感度
20以上 极敏
15~20 高敏
10~14 中敏
10以下 低敏
0 不敏

  二、药物敏感实验判定标准参考表1,多黏菌素抑菌圈;在9毫米以上为高敏,6—9毫米为低敏,无抑菌圈为不敏。

影响药敏结果的因素

  一、培养基:应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时,厚度合适(约5-6mm),不可太薄,一般90mm直径的培养皿,倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质,如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性,胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸(PABA)能拮抗磺胺药和TMP的活性。

  二、细菌接种量:细菌接种量应恒定,如太多,抑菌圈变小,能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

  三、药物浓度:药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果,需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

  四、培养时间:一般培养温度和时间为37℃ 8-18小时,有些抗菌药扩散慢如多粘菌素,可将已放好抗菌药的平板培养基,先置4℃冰箱内2~4小时,使抗菌药预扩散,然后再放37℃温箱中培养,可以推迟细菌的生长,而得到较大的抑菌圈。

药敏试验的应用

  药物敏感实验后,应选择高敏药物进行治疗,也可选用两种药物协助使用,以减少耐药菌株。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径,因为我们药敏实验是药液直接和细菌接触,而在给禽用药的时候,必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果,所以在给禽用药时,高敏药物一定要配合适宜的给药方法,这样才会达到好的治疗效果。文章来自:网络转载!

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